線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性測試盒實驗科研

測定意義：線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測定原理：復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定復(fù)合體Ⅴ活性。

需要的儀器，耗材:可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。


樣本處理
1. 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2. 4 ℃ 600g 離心 10min。

3. 將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000g 離心 15min。

4. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。

5. 在沉淀中加入 600μL 試劑一，超聲波破碎（功率 20%，超聲 5 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 12 次），用于復(fù)合體Ⅴ酶 活性測定，并且用于蛋白含量測定。